عنوان		صفحه
چکیده		1
مقدمه		2
فصل اول: مروری بر تحقیقات گذشته
1- گیاهشناسی سیب زمینی		4
1-1) برگ		4
1-2) ساقه		4
1-3) غده		5
1-4) جوانه		5
1-5) ریشه		5
1-6) گل		5
2- ارقام سیب زمینی		5
2-1) رقم‌هاى خیلى ‌زودرس و زودرس		5
2-2) رقم­‌هاى متوسط رس یا میان‌رس		6
2-3) رقم­‌هاى دیررس		6
3- تاریخچه		7
4- مواد موجود در سیب زمینی		8
5- مراحل کشت سیب زمینی		8
5-1) آماده کردن زمین برای کاشت سیب­زمینی		8
5-2) آماده‌کردن غده­‌ها براى کاشت سیب­زمینی		9
5-3) کاشتن غده­‌ها		10
5-4) آبیاری سیب زمینی		11
5-5) کوددهی سیب­زمینی		11
5 -6) وجین کردن و خاک دادن سیب­زمینی		12
5-7) برداشت		13
6- مراحل پس از برداشت و فرآوری سیب زمینی		14
7- اهمیت اقتصادی سیب­زمینی		15
8- ویروس­های بیماریزای سیب­زمینی		17
9- ویروس ایکس سیب­زمینی Potato virus X		20
9-1) آرایه­بندی		20
9-2) علائم		21
9-3) دامنه میزبانی طبیعی ویروس ایکس سیب­زمینی		22
9-4) گونه های میزبانی بکار رفته جهت تشخیص PVX		23
9-5) انتقال و انتشار ویروس		23
9-6) پراکنش جغرافیایی		24
9-7) خصوصیات ژنوم		24
9-8) خصوصیات پیکره ویروس		26
9-9) تکثیر ویروس ایکس سیب­زمینی در گیاه		27
9-10) تنوع ژنتیکی ویروس ایکس سیب­زمینی		28
10- روش­های ردیابی ویروس ایکس سیب­زمینی		30
10-1) سرولوژی		30
10-2) بررسی­های مولکولی واکنش زنجیره­ای پلی­مراز Polymerase Chain Reaction (PCR)		32
11- مطالعات انجام شده در ایران		37
12- هدف از این تحقیق		40
فصل دوم:مواد و رو ش­ها
1- جمع آوری نمونه از مزارع سیب­زمینی		42
2- آزمون الایزا Enzyme-Linked Immunosorbent Assay- ELISA))		42
2-1) تهیه بافرها		42
2-1-1) بافرفسفات پتاسیم(PH, 7.4), (phosphate buffered saline-PBS)		43
2-1-2) بافر پوششی کربنات سدیم(PH, 9.6) , (Coating buffer)		43
2-1-3) بافر شستشو (PH,7.4),(Washing buffer)		43
2-1-4) بافر عصاره گیری (PH,7.4),(Extraction buffer)		43
2-1-5) بافر ترکیب پادتن-آنزیم (PH,7.4),(Conjugate buffer)		43
2-1-6) بافر زمینه (سوبسترا)(PH, 9.8),(Substrate buffer)		44
3- بررسی­های گلخانه­ای		45
4- بررسی انتقال	46
4-1) بررسی انتقال با سس	46
4-2) انتقال با تماس	46
5- بررسی خصوصیات مولکولی	46
5-1) استخراج آر.ان.ای (RNA Extraction)	46
5-2) واکنش زنجیره­ای پلی­مراز به روش رونوشت برداری برگردان (RT-PCR)	48
5-2-1) مرحله رونوشت برداری برگردان (Reverse transcriptase)	48
5-2-2) مرحله واکنش زنجیره ای پی. سی. آر	48
5-3) مشاهده محصول واکنش	49
5-4) خالص سازی قطعات تکثیر شده	49
5-4-1) جدا کردن قطعه ژل حاوی DNA تکثیر شده	49
5-4-2) حل کردن قطعه ژل و آزاد شده قطعه DNA	49
5-4-3)رسوب دادن DNA	50
5-4-4)شستشوی رسوب با بافر شستشو	50
5-4-5) حل شدن DNA در آب	50
5-6) آنالیز تبارازیی	51
6- خالص سازی ویروس PVX	53
7- اسپکتروفتومتری و تعیین غلظت ویروس جدا شده در آموده های(پرپارسیون) خالص شده	55
فصل سوم:نتیجه گیری
1- بررسی علائم آلودگی­های موجود روی سیب زمینی	56
1-1) علائم آلودگی روی سیب زمینی	56
1-2) نشانه­ های آلودگی روی گوجه فرنگی	57
2- آزمون بیولوژیکی (واکنش گیاهان محک در مقابل عصاره حاوی ویروس ایکس)	58
2-1) گل تکمه­ایی Gomphrena globosa L.	58
2-2) داتوره Datura stramonium	59

2-3) سلمکChenopodium amaranticolor	59
2-4) توتون Nicotiana glutinosa L	60
2-5) توتون Nicotiana tabacum. cv. White Burley	60
2-6) توتون Nicotiana tabacum. cv. Samsun	61
2-7) گوجه فرنگی Lycopersicum esculentum Mill	61
2-8) لوبیا Phaseolus vulgaris L.cv. Bountiful	61
2-9) باقلا. Vicia faba	61
2-10) ماش. Vicia sativa L.	62
2-11) دامنه میزبانی و علائم	62
3- درجه حرارت غیر فعال شدن (TIP)	63
4- آخرین حد رقت (DEP)	63
5- پایداری ویروس در شرایط آزمایشگاه (LIV)	63
6- مطالعه روش های انتقال	63
6-1) انتقال با سس	63
6-2) انتقال با تماس	63
7- خالص سازی	63
7-1) روشShepard, 1972	63
7-2) روشFribourg,1975	64
7-3) روشMoreira, 1980	65
8- تعیین پراکنش ویروس بر اساس آزمون الایزاELISA	65
9- بررسی خصوصیات مولکولی	72
9-1) نتایج حاصل از استخراج آر.ان.ای کل گیاه (RNA Extraction)	72
9-2) نتایج واکنش رونوشت برداری برگردان زنجیره­ای پلی­مراز (RT-PCR)	73
10) آنالیز تبازایی	74

 

فصل چهارم:بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات	76
فهرست منابع فارسی	84
فهرست منابع انگلیسی	85
چکیده انگلیسی	96

فهرست جداول
عنوان	صفحه
جدول1-1 اسامی ویروس های سیب زمینی	18
جدول 1-2 مقایسه بین ELISA, PCR, IC-PCR, RT-PCR-ELISA	35
جدول1-3 توالی آغازگرهای استفاده شده برای سنتز cDNA جهت ردیابی ویروس ایکس سیب­زمینی	37
جدول2-1 منطقه و تعداد نمونه های جمع آوری شده از مزارع سیب زمینی در همدان	42
جدول2-2 گیاهان میزبانی که برای مایه زنی ویروس ایکس سیب زمینی استفاده شد	45
جدول2-3 آغازگرهای استفاده شده در آزمون RT-PCR	49
جدول2-4 لیست توالی‌های کامل پروتئین پوششی PVX موجود در بانک ژن که برای مقایسه با جدایه‌های ایرانی مورد استفاده قرار گرفته‌اند	52
جدول3-1درصد نمونه های علائم دار جمع آوری شده از مزارع همدان	57
جدول3-2 علائم ویروس ایکس بروی گیاهان محک	62
جدول 3-3 درصد آلودگی به چهار ویروس PVX، PVY، PVS و PLRV در مناطق بهار، رزن و کبودرآهنگ	65
جدول3-4 درصد آلودگی همزمان در مزارع استان همدان	66

فهرست نمودارها
عنوان	صفحه
نمودار1-1 توزیع میزان تولید سیب زمینی در استانهای کشور	16
نمودار3-1(Shepard, 1972) Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation	64
نمودار3-2(Fribourg,1975)   Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation	64
نمودار3-3 Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation(Moreira,1980)	65
نمودار3-4 نمودار 3-4درصد آلودگی در مزارع سیب زمینی منطقه بهار	68
نمودار3-5 درصد آلودگی در مزارع سیب زمینی در منطقه رزن	69
نمودار3-6 درصد آلودگی مزارع سیب زمینی در منطقه کبودر آهنگ	71
نمودار3-7 درصد آلودگی ویروس های سیب زمینی در مزارع سیب زمینی استان همدان	72

فهرست اشکال
عنوان	صفحه
شکل1-1 ویروس PVX همراه با ویروس TMV حالت هم افزایی داشته و علائم شدید Double streak را ایجاد می­ کند	21
شکل1-2 گیاه سیب زمینی آلوده به ویرو س ایکس سیب زمینی با علائم موزاییک	22
شکل1-3 مدل حرکت Potexivirus	26
شکل1-4 مقایسه حساسیت روش های RT-PCR(A) و DAS-ELISA (B) برای ردیابی ویروس ایکس سیب زمینی	34
شکل 3-1 علائم موزائیک و نکروز در بوته سیب زمینی آلوده به دو ویروس ایکس و وای سیب زمینی	57
شکل 3-2 نمونه گوجه فرنگی مشکوک به علائم ویروسی	58
شکل3-3 لکه های نکروز، 15 روز پس از مایه زنی عصاره حاویPVX روی گل تکمه ایی	58
شکل3-4 لکه های سبز روشن پس از 10 روز مایه زنی عصاره حاویPVX روی داتوره	59
شکل3-5 ظهور لکه های سبزرد( کلروتیک) (سمت راست) و سپس سیستمیک در گیاه سلمک (سمت چپ)	59
شکل3-6 لکه­های سبزرد (کلروتیک) و موزاییک روی برگ N.glutinosa L مایه زنی شده توسط عصاره حاویPVX	60
شکل3-7علائم پیسک (ماتل)و رگبرگ روشنی روی Nicotiana tabacum. cv.White Burley مایه زنی شده توسط جدایه PVX	60
شکل3-8 علائم لکه های کلروز و نکروز سیستمیک در گیاه گوجه فرنگی 12 روز بعد از مایه زنی توسط PVX	61
شکل3-9 علائم زردی و موزائیک روی برگ­های ماش مایه زنی شده توسط عصاره حاویPVX	62
شکل3-10 عکس از باند حاصل شده ازRNA استخراج شده بروش Tri-Reagent	73
شکل 3-11 الکتروفورز محصولات PCR مربوط به تکثیر پروتئین پوششی با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی، در ژل آگاروز یک درصد	74
شکل 3-12 درخت تبارزایی جدایه‌های ایرانی PVX با سایر جدایه‌ها که با روش NJ و 100 مرتبه bootstrap بدست آمده است.	75

چکیده:
ویروس ایکس سیب­زمینی (Potato virus X- PVX) گونه شاخص جنس Potexvirus از خانواده Alfaflexiviridae می­باشد. طی سال های 1389 و 1390، از مناطق کشت اصلی سیب زمینی در استان همدان بازدید و نمونه برداری انجام گرفت. مجموعاً 456 نمونه برگی (تعداد 132 و 324 نمونه بترتیب علائم­دار و تصادفی) از 9 مزرعه واقع در مناطق بهار، کبودرآهنگ و رزن جمع آوری گردید. نتایج آزمون الایزا با بهره گرفتن از آنتی بادی اختصاصی (بیوربا-سویس) نشان دهنده آلودگی 42 نمونه با ویروس ایکس سیب زمینی بود. بر اساس آزمون الایزا میزان وقوع آلودگی به این ویروس به ترتیب کاهش در مناطق بهار، رزن و کبودرآهنگ تعیین گردید. برای تایید نتایج حاصل از آزمون سرولوژیکی از روش های بیولوژیکی و مولکولی استفاده شد. مطالعه دامنه میزبانی جدایه های ایرانی ویروس ایکس سیب زمینی با بهره گرفتن از گیاهان محک مختلف، تفاوتی نشان داد. همچنین در این تحقیق ناحیه ژن پروتئین پوششی ویروس بطول حدود 750 جفت باز با بهره گرفتن از آغازگر های اختصاصی تکثیر گردید. آنالیز تبارزایی با بهره گرفتن از توالی کامل پروتئین پوششی دو جدایه ویروس شامل Iran H1 و Iran H2 با توالی‌های مربوط به جدایه های خارجی PVX موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه های ایرانی در گروه اروپا-آسیا (Eurasia) قرار می گیرند. در درخت تبارزایی جدایه های تعیین توالی شده در این بررسی با جدایه ویروس ایکس جدا شده از نخود (Pisum sativum) در یک شاخه مستقل و نزدیک بهم قرار گرفتند. طول کامل توالی پروتئین پوششی 714 نوکلئوتید بود که پروتئینی با 237 اسیدآمینه تولید می نماید. این نتایج با نتایج بدست آمده در مورد سایر جدایه های این ویروس از مناطق دیگر دنیا مطابقت دارد. هر چند که جدایه های ایرانی مورد مطالعه در گروه اروپا-آسیا قرار می گیرند ولی هنوز مشخص نیست که آنها جدایه های غالب این ویروس در ایران باشند. برای این منظور لازم است تا جدایه های بیشتری از این ویروس از مناطق خاورمیانه و سایر کشورها تعیین توالی شوند. هر چند بر اساس مطالعات ما این اولین گزارش از آنالیز تبارزایی این ویروس جدا شده از سیب زمینی از ایران