پایان نامه بررسی ارتباط تشکیل بیوفیلم باکتری اشریشیا کلی یوروپات
استاد راهنما:
نازیلا ارباب سلیمانی
استاد مشاور:
الهه تاج بخش
تکه هایی از متن به عنوان نمونه :
| فهرست مطالب | ||
| عنوان | صفحه | |
| چکیده | 1 | |
| فصل اول: کلیات تحقیق | ||
| مقدمه | 2 | |
| فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته | ||
| 2ـ1ـ اشریشیا کلی یوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC) | 4 | |
| 2ـ2ـ فاکتور های بیماری زای تولید شده توسط UPEC | 5 | |
| 2ـ2ـ1ـ ادهسین ها و فاکتور های موثر در کلونیزاسیون | 5 | |
| 1_2_2_1_ پیلی یا فیمبریه (Fimbriae) | 5 | |
| 2_2_2_1_ فیمبریه نوع | 6 | |
| 3_2_2_1_ فیمبریه P | 7 | |
| 4_2_2_1_ فیمبریه S | 8 | |
| 5_2_2_1_ تاژک و تحرک | 9 | |
| 6_2_2_1_ Curli | 10 | |
| 7_2_2_1_ پیلی F جنسی | 11 | |
| 2ـ2ـ2ـ توکسین ها | 11 | |
| 1_2_2_2_ آلفا همولیزین | 12 | |
| 2_2_2_2_ فاکتور نکروز دهنده سیتوتوکسیک (CNF_1) | 12 | |
| 2ـ2ـ3ـ بقاء و فرار از سیستم ایمنی | 12 | |
| 1_2_2_3_ سیدروفور ها (آئروباکتین) | 12 | |
| 2_2_2_3_ کپسول پلی ساکاریدی | 13 | |
| 3_2_2_3_ تشکیل بیوفیلم | 14 | |
| 2ـ3ـ عفونت های مجاری ادراری( Urinary Tract Infection; UTI) | 14 | |
| 2ـ3ـ1ـ نقش پیلی در عفونت های مجاری ادراری | 16 | |
| 2ـ4ـ بیوفیلم ها | 17 | |
| 2ـ4ـ1ـ توسعه بیوفیلم | 18 | |
| 2ـ4ـ2ـ مقاومت آنتی بیوتیکی در بیوفیلم ها | 20 | |
| 2ـ4ـ3ـ بررسی ارتباط بین تشکیل بیوفیلم، فاکتورهای یوروویرولان و مقاومت ضد میکروبی | 22 | |
| 2ـ5ـ نقش آب گریزی (Hydrophobicity) در اتصال باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن | 23 | |
| فصل سوم : مواد و روش ها | ||
| 3ـ1ـ مواد و وسایل | 24 | |
| 3ـ1ـ1ـ محیط های کشت استفاده شده | 24 | |
| 3ـ1ـ2ـ مواد شیمیایی | 24 | |
| 3ـ1ـ3ـ کیت ها | 24 | |
| 3ـ1ـ4ـ دستگاه ها | 24 | |
| 3ـ2ـ جمع آوری نمونه ها | 25 | |
| 3ـ3ـ جداسازی و خالص سازی | 25 | |
| 3ـ4ـ مشاهده میکروسکوپی | 25 | |
| 3ـ5ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتریUPEC | 26 | |
| 3ـ6ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت | 26 | |
| 3ـ7ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با بهره گرفتن از هیدروکربن اکتان | 26 | |
| 3ـ8ـ استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت استخراج DNA شرکت سینا ژن | 28 | |
| 3ـ9ـ تعیین کیفیت DNA با بهره گرفتن از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز | 28 | |
| 3ـ10ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR) | 29 | |
| 3_11_ الکتروفورز ژل آگارز | 31 | |
| فصل چهارم: نتایج | ||
| 4ـ1ـ آزمایشات تشخیصی برای تعیین اشریشیا کلی یوروپاتوژن (UPEC) | 33 | |
| 4ـ2ـ فراوانی باکتریهای بیماریزای جدا شده از ادرار | 34 | |
| 4ـ3ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC | 34 | |
| 4ـ4ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت | 36 | |
| 4ـ5ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با بهره گرفتن از هیدروکربن اکتان | 38 | |
| 4ـ6ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR) | 40 | |
| فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری | ||
| 5ـ1ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC | 52 | |
| 5ـ2ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت | 44 | |
| 5ـ3ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با بهره گرفتن از هیدروکربن اکتان | 45 | |
| 5ـ4ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR) | 46 | |
| نتیجه گیری | 48 | |
| پیشنهادات | 49 | |
| منابع و مآخذ | 50 | |
| چکیده انگلیسی | 57 | |
| فهرست شکل ها | |
| عنوان | صفحه |
| شکل 1_1_ تفاوت Pili و Curli | 11 |
| شکل 1_2_ کپسول پلی ساکاریدی | 13 |
| شکل1_3_ مراحل توسعه یافتگی بیوفیلم | 19 |
| شکل4_1_ کلنی ها با جلای فلزی UPEC | 34 |
| شکل 4_2_ باسیل های گرم منفی UPEC | 34 |
| شکل 4_3_ محیط های افتراقی جهت بررسی E.coli جدا شده از ادرار | 34 |
| شکل 4_4_ هاله عدم رشد UPEC در حضور آنتی بیوتیک ها | 36 |
| شکل 4_5_ تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت با بهره گرفتن از روش اتصال به کریستال ویوله (CV) | 37 |
| شکل 4_6_ بررسی هیدروفوبیسیتی(قدرت اتصال) UPEC با بهره گرفتن از هیدروکربن اکتان | 39 |
| شکل 4_7_ نتایج الکتروفورز محصولPCR جهت شناساییژن هایpap (328 bp) و sfa (410 bp | 41 |
چکیده
عفونت دستگاه ادراری یکی از شایعترین عفونت های بیمارستانی است که از کلونیزه شدن اشرشیا کلی یوروپاتوژن در اپیتلیوم مخاطی میزبان ناشی می شود و به بافت میزبان آسیب می رساند. ساختارهای مختلف سطح سلولی در تشکیل بیوفیلم در اشرشیاکلی یوروپاتوژن دخیل هستند. از جمله فاکتورهای سطحی در اتصال باکتری و تشکیل بیوفیلم، پیلی P و S می باشد. هدف از این مطالعه تعیین میزان مقاومت آنتی بیوتیکی ، بررسی تشکیل بیوفیلم اشریشیا کلی یوروپاتوژن، سنجش قدرت اتصالی یا خاصیت هیدروفوبیسیتی آن و بررسی وجود ژن های فیمبریه ای pap وsfa و ارتباط آنها در تشکیل بیوفیلم بود.
در این تحقیق تعداد 100 نمونه از کشت باکتری بیماران مشکوک به عفونت دستگاه ادراری (UTI) جمع آوری گردید. با بهره گرفتن از تست های بیوشیمیایی متداول E.coli بودن 70 نمونه تایید گردید. مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن با بهره گرفتن از روش Kirby – Bauer مورد بررسی قرار گرفت. تشکیل بیوفیلم این باکتری با روش میکروتیترپلیت بررسی شد. به منظور بررسی اتصال باکتری و میزان هیدروفوبیسیتی ، روش هیدروکربن اکتان استفاده شد. پس از استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت استخراج، حضور ژن های pap و sfa به روش Multiplex PCR مورد بررسی گرفت.
از مجموع 100 نمونه مورد بررسی به کمک روش های بیوشیمیایی متداول 70 نمونه به عنوان اشریشیا کلی یوروپاتوژن شناسایی شدند. نتایج نشان دادن که این باکتری با هیدروفوبیسیتی 23% توانایی تشکیل بیوفیلم را دارد. از نظرمیزان تشکیل بیوفیلم 86% قدرت بسیار کم، 8/2 ? قدرت متوسط و 2/11? دارای قدرت بسیار بالا نشان دادند. همچنین بر اساس نتایج بدست آمده از آزمایش Multiplex PCR بر روی 10 نمونه ای که بالاترین قدرت تشکیل بیوفیلم را داشتند، 10نمونه (100?) واجد ژن pap، 7 نمونه (70?) واجد ژن sfa و 7 نمونه (70?) نیز به طور همزمان دارای ژن pap و sfa بودند.
نتایج این مطالعه نشان داد که ژن های pap و sfa شایعترین ژن های کد کننده پیلی در اشریشیا کلی های جدا شده از عفونت ادراری هستند که می توانند به اتصال این باکتری به بافت های میزبانی و تشکیل بیوفیلم های مقاوم به آنتی بیوتیک کمک کنند.
واژه های کلیدی: عفونتهای دستگاه ادراری، اشریشیا کلی یوروپاتوژن، تشکیل بیوفیلم، Multiplex PCR
مقدمه:
اشریشیا کلی بیشترین گونه باسیل گرم منفی شایع در فلور مدفوعی است. این باکتری یک گونه فوق العاده متنوع است که توانایی کلونیزه شدن و پایداری در نیچ های بیشماری در میزبان های حیوانی، انسانی و محیط را دارد. بعضی از سویه های اشرشیا کلی می توانند از سویه های کامنسال خودشان متمایز شوند، بیماریزایی طبیعی بیشتر و توانایی ایجاد بیماریهای جدی تر در دستگاه گوارش، بافت ها و اندام های دیگر میزبان ایجاد کنند. این سویه های پاتوژن به طور گسترده به عنوان اشرشیا کلی اسهال زا یا اشرشیا کلی پاتوژن خارج روده ای Extra-intestinal Pathogenic E.coli;ExPEC ) ) طبقه بندی می شوند. از میان ExPEC ها، سویه های اشرشیاکلی یوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC)با بیماریزایی انسانی در ارتباط است. سویه های UPEC به عنوان فرصت طلب داخل سلولی عمل می کنند و با توجه به حساسیت و رفتار میزبان و توسط به کارگیری فاکتورهای ویرولان مختلف برای کلونیزه شدن در دستگاه ادراری برتری کسب می کنند. ( Johnson et al. 1998; Johnson. 2002; Marrs et al. 2005)
UPEC در مجاری ادراری می تواند در مثانه کلونیزه شود و ایجاد التهاب مثانه (Cystitis) کند و همچنین می تواند از طریق حالب به کلیه ها صعود کرده و باعث ایجاد پیلونفریت (Pyelonephritis) شود. مولکول و ساختارهای مختلف سطح سلولی در تشکیل بیوفیلم در اشرشیاکلی یوروپاتوژن دخیل هستند (Marrs et al,2005)
بیوفیلم ها مجموعه ای از سلول های میکروبی هستند که به طور برگشت ناپذیر به سطح وابسته اند و به وسیله شستشو ملایم از بین نمی روند. علاوه بر این، تمایز سلول های غیر متصل (Planctonic) به شکل بیوفیلم بالغ، تغییرات فنوتیپی را ایجاد می کند که دارای پیامد های عمده ای از قبیل افزایش مقاومت به عوامل ضد میکروبی و ازبین نرفتن توسط دفاع میزبان است. این تغییرات فنوتیپی باعث تغییر سلول های اشرشیا کلی از حالت غیر متصل (Planctonic) به حالت متصل می شود.(Hanna. 2003)
بیش از 50% همه عفونت های باکتریایی گزارش شده شامل تشکیل بیوفیلم اند. رشد بیوفیلم باکتریهای پاتوژن اغلب منجر به عفونت هایی می شود که تحمل به آنتی بیوتیک ها و پاسخ های ایمنی میزبان را افزایش می دهد ( Lane et al.2007).
