دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

پایان نامه برای دریافت درجه ی کارشناسی ارشد در رشته علوم گیاهی

گرایش تکوین

عنوان

بررسی اثرات غلظت­های مختلف سدیم کلرید ( NaCl) بر کشت بافت بنفشه آفریقایی(Saintpaulia inantha)

استاد راهنما

دکترمصطفی عبادی

استاد مشاور

دکترحسین عباسپور

 
تکه هایی از متن به عنوان نمونه :
فهرست مطالب
 چکیده 1
مقدمه. 2
 فصل اول/ کلیات تحقیق
1-1 گیاهشناسی بنفشه آفریقایی: 8
1-2 خاستگاه و پراکنش بنفشه آفریقایی 10
1-3 گونه های مهم بنفشه آفریقایی: 11
1-4 برخی گونه های فهرست شده به دنبال طبقه بندیBurtt. 11
1-5 کشت و تکثیر: 13
1-6 شرایط کشت بنفشه آفریقایی: 13
1-6-1 دما: 13
1-6-2 نور: 14
1-6-3 تنظیم رطوبت: 15
1-6-4 مقدار دی اکسید کربن: 15
1-6-5 مواد رشد: 15
1-6-6 آب دهی: 15
1-7 مشخصات و انواع خاک: 16
1-8 تغذیه گیاه: 16
1-8-1 نیتروژن: 16
1-8-2 فسفر: 17
1-8-3 پتاسیم: 17
1-8-4 منیزیم: 17
1-8-5 کلسیم: 17
1-8-6 گوگرد: 17
1-9 بیماریهای مربوط به بنفشه آفریقایی 18
1-9-1 زردی برگ: 18
1-9-2 برگهای رنگ پریده با ساقه های بلند: 18
1-9-3 ندادن گل: 18
1-9-4 بیماری های ناشی از قارچ: 18
1-9-4-1 شل شدن برگها و پوسیدگی ریشه: 19
1-9-4-2کپک زدن برگها و گلها: 19
1-9-4-3 بیماری پوسیدگی یا کپک قارچی: 19
1-9-5 بیماریهای ویروسی: 20
1-9-6 آفات: 20
1-9-7 کپک پودری ((Oidium SPP: 21
1- 10 اهمیت بنفشه آفریقایی: 21
1-11اصلاح بنفشه آفریقایی 22
1-11-1روشهای اصلاحی 22
1-12کشت بافت: 22
1-13تاریخچه کشت بافت گیاهی: 22
1-14 اهمیت کشت بافت گیاهی: 30
1-16 تکنیک های کشت بافت گیاهی: 31
1-16-1 کشت کالوس: 31
1-16-2 کشت سلولی : 31
1-16-3 کشت اندام : 32
1-16-4 کشت مریستم و ریخت زایی یا مرفوژنز : 32
1-16-5 جداسازی اسپتیک پروتوپلاست های گیاهان. 32
1-17 کاربردهای مهم کشت بافت گیاه: 32
1-18 محدودیتها یا همان معایب کار. 33
1-19 موارد کاربردی در کشاورزی: 34
1-20 موارد کاربرد ی در صنعت: 34
1-21 اهمیت و کاربرد کشت بافت در باغبانی: 34
1-22 انواع کشت در شیشه: 35
1-22-1 سازمان یافته : 35
1-22-2 سازمان نیافته : 35
1- 23 انواع مختلفی از کشت در شیشه نیز وجود دارد. 36
1-23-1 کشت گیاه کامل: 36
1-23-2 کشت جنین: 36
1-23-3 کشت کالوس: 36
1-23-4 کشت سلول : 36
1-23-5 کشت پروتوپلاست : 37
1-24کلر: 37
1-25 پراکسیداز: 38
1-26 کاتالاز: 38
1-27 کلروفیل: 39
1-28 پرولین: 40
1-29 کربوهیدراتهای محلول و نا محلول: 41
1-30 شوری: 41
1-31 مکانیسم اثر شوری: 42
1-32 تاثیر در ساختار ریختی: 44
1-33 اثرات تنش شوری بر پارامترهای رشد در گیاه: 44
1-34 تغییر در ساختار تشریحی: 46
1- 35 تغییر در ساختار مریستمها: 46
1-36 اثرات تنش شوری بر فتوسنتز: 46
 فصل دوم/ مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1 روش های ریز ازدیادی بنفشه آفریقایی 49
2-1-1 بیلکی و همکارانش: 49
2-1-2کوک 50
2-1-3 شریفی و همکاران. 51
2-1-4 سیف الله خان و همکاران. 51
2-1-5 سمیرحسین و همکاران. 52
2-1-6 ویچادا سانپوی و همکارانش. 52
2-1-7 عبادی وهمکارانش. 53
2-1-8 عبادی و همکارانش. 53
2-1-9 مارکس و همکارانش. 54
2-2 اثرات تنش شوری بر گیاهان. 54
2-2-1 اثر شوری بر دیواره سلولی 54
2-2-2 اثر شوری بر غشا: 55
2-2-3 اثر شوری بر تراکم یونها در گیاه: 55
2-2-4 اثر شوری بر اسمولیتها: 58
2-2-5 اثر شوری بر پرولین: 59
 مواد و روش­ها /فصل سوم
3-1 تهیه محلول های ذخیره و محیط کشت: 62
3-1-1 محلول های مادری نمک های پرمصرف با غلظت 10 برابر ( ): 62
3-1-2 محلول های مادری نمک های کم مصرف با غلظت 1000برابر (1000 × ) 63
3-1-3 محلول مادری Na_2. EDTA.2H₂O , FeSO_4. 7H₂O با غلظت 10 برابر (10 × ) 63
3-1-4 محلول مادری ویتامین ها و گلایسین 100 برابر (100 ×) : 64
3-1-5 محلول مادری هورمون ها: 64
3-2 تهیه یک لیتر محیط کشت پایه MS از محلول های مادری: 65
3-2-1 اکسین: 65
3-2-2سیتوکنین (BAP): 65
3-2-3 ویتامینها: 65
3-2-4 میواینوزیتول: 66
3-2-5 عامل ژلی: 66
3-3 روش تهیه گیاه پایه استریل: 66
3-3-1 مراحل سترون سازی 66
3-3-2 سترون سازی برگها : 66
3-3-3 سترون سازی محیط و وسایل کار: 67
3-4 تولید گیاهان سترون جهت تیمارهای مختلف: 68
3-5 کشت گیاه در محیط های تیماری: 68
3-6 آنالیز رشد: 69
3-7 سنجش رنگیزه های فتوسنتزی (آرنون، 1957): 69
3-8 سنجش کربوهیدرات (کوچرت،1978): 70
3-8-1 اندازه گیری قندهای محلول: 70
3-8-2 اندازه گیری قندهای نامحلول ( نشاسته ): 71
3-9 سنجش پرولین (باتیس و همکاران، 1973): 71
3-10 سنجش فعالیت آنزیمی 72
3-10-1 سنجش آنزیم پراکسیداز (کوری1989) 72
3-10-2. سنجش آنزیم کاتالاز (چانز،1955) 73
3-11. سنجش پروتئین ها (لاوری و همکاران، 1951) 73
 فصل چهارم/ نتایج تحقیق
4-1 اثر غلظتهای مختلف کلرید سدیم بر خصوصیات مورفولوژیکی و رویشی گل بنفشه آفریقایی 76
4-2 نتایج حاصل از اثرات مختلف کلرید سدیم پس از 40 روز تیمار در محیط کشت پایه MS. 78
4-2-1 تغییرات حاصل از اثرات تیمار با غلظتهای مختلف کلرید سدیم در پارامترهای رشد. 78
4-2-1-1 تغییرات وزن تر اندام هوایی در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی: 78
4-2-1-2 تغییرات وزن خشک اندام گیاهی در گیاه بنفشه آفریقایی 79
4-2-1-3 تغییرات سطح برگ در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی: 80
4-2-1-4 تغییرات تعداد برگ در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 81
4-2-1-5 نسبت سطح برگ LAR ( Area Ratio Leaf) در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 82
4-2-1-6 وزن مخصوص برگ SLW (Specific Leaf Weight) گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 83
4-3 تغییرات بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 84
4-3-1 سنجش میزان تغییرات انواع کلروفیل. 84
4-3-1-1 تغییرات کلروفیل a در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 84
4-3-1-3 تغییرات کلروفیل کل (a+b) در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 86
4-4 تغییرات میزان قندهای محلول در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 87
4-5 تغییرات میزان قندهای نامحلول(نشاسته) در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 88
4-6 تغییرات میزان آنزیم پراکسیداز در گیاه 40 روزه گیاه بنفشه آفریقایی 89
4-7 تغییرات میزان آنزیم کاتالاز در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 90
4-8 تغییرات میزان پرولین در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 91
4-9 تغییرات میزان پروتئین در گیاه 40 روزه بنفشه آفریقایی 92
 فصل پنجم/ بحث و نتیجه گیری
5- 1 بررسی اثر شوری بر پارامترهای رشد. 94
5-1-1 وزن خشک و وزن تر گیاه: 94
5-2 اثر تنش شوری بر محتوای کلروفیل: 95
5-3 اثر شوری بر محتوای پرولین در بنفشه آفریقایی: 97
5-4 اثر شوری بر میزان فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی در بنفشه آفریقایی 99
5-4-1 فعالیت کاتالاز: 99
5-4-2 پراکسیداز: 100
5-5 اثر شوری بر میزان پروتئین: 101
5-6 اثر شوری بر میزان اسمولیتها 102
5-6-1 قندهای محلول: 102
5-6-2 قندهای نا محلول: 102
5-7 نتیجه گیری نهایی: 104
5-8 پیشنهادات 105
منابع. 106
چکیده
گیاهان برای مقابله با اثرات مضر تنش شوری استراتژی­های متفاوتی را در پیش می­گیرند که می­توان به پایین نگه­داشتن پتانسیل آب درونی خود با انباشتن انواع اسمولیت­های سازگار، افزایش آنزیم­های آنتی اکسیدانی، حمایت از فعالیت فتوسنتز و حفظ هموستازی یون­ها اشاره کرد. در این پژوهش اثر غلظتهای مختلف کلرید سدیم NaCl (0، 0.5، 1، 1.5، 2 و4) میلی گرم بر لیتر بر برخی خصوصیات فیزیولوژیکی، مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه زینتی بنفشه آفریقایی در شرایط کشت بافت گیاهی با بهره گرفتن از محیط کشت موراشی و اسکوک MS مورد بررسی قرار گرفت. آزمایشات در قالب طرح کاملا تصادفی و در سه تکرار در شرایط آزمایشگاهی انجام گردید .آنالیز­های آماری داده­ ها با بهره گرفتن از نرم افزار SPSS انجام شد. میانگین­ها با استفاده ازآزمون دانکن در سطح ( 0.05≤ P) مقایسه شد. برای رسم نمودار­ها از نرم افزار EXCEL استفاده گردید. نتایج آنالیز آماری آزمایشهای پارامتر­های رشد نشان داد که با افزایش غلظت نمک کلرید سدیم، میزان وزن ترو وزن خشک گیاه افزایش یافت. و همچنین وزن مخصوص برگ ALW  وسطح برگ افزایش داشت . نسبت سطح برگی LAR  و تعداد برگها کاهش یافت. تیمار نمک باعث افزایش در یونهای سدیم، کلر، محتوای پرولین ، پراکسیداز، آنزیم کاتالاز و قندهای محلول گردید. و همچنین باعث کاهش در محتوای قندهای نامحلول، میزان پروتئین و میزان رنگیزه­های فتوسنتزی از جمله کلروفیل­های (a,b,ab) گردید.
واژگان کلیدی: کلرید سدیم ، پراکسیداز، کاتالاز، کشت بافت، بنفشه آفریقایی
مقدمه
بنفشه آفریقایی گیاهی زیبا با نام علمی ionantha Saintpaulia ازتیره Gesneriaceaeونام معمول   Afrecan violet  می­باشد. این گیاه مهمترین گونه زینتی از میان 20 گونه متعلق به جنس Saintpaulia است. بنفشه آفریقایی به عنوان عروس گل ­های آپارتمانی در اروپا مطرح است که نقش بسزایی در فراهم آوردن محیطی آرام وزیبا بازی می­ کند. بنفشه آفریقایی در سال 1892درشرق آفریقا توسط بارون والتر فونت سنت پل کشف گردید. او به افتخارنام خانوادگی خود که برای اولین بار این گیاه را کشف نموده بود،آن را سنت پولیا نام گذاری کرد. آب هوای حاره­ای، شرایط مناسبی برای رشد این گیاه می باشد(استیود [1]،1998). این گیاه بومی نقاط گرمسیری آفریقای جنوبی است و از لحاظ کروموزومی دیپلوئید بوده وبه صورت 302n=است(مایرانتو[2]،2005). بنفشه آفریقایی گیاهی نهاندانه بوده و بذرهای آن در تخمدان گل محفوظ می ماند. جزء گیاهان دو لپه است. این گیاه جام لوله­ای کوتاه داردوجام گل به طور معمول دو لپه است، یعنی به دو دسته گلبرگ­های بالا وپائین تقسیم می­شود. هر یک از گل­ها دارای 2-4 بساک، مسئول تولید گرده بوده که به انتهای گل متصل است و نزدیک تخمدان قرار دارد. برگهای سبز مخملی و کرکدار در روی ساقه فشرده و کوتاه قرار دارند. ساقه که گل­ها را بر روی خود نگه می­دارد از دو قسمت اصلی وفرعی تشکیل شده است. رنگ بنفش گل این گیاه در یک دوره گلدهی ممکن است به صورت تیره ویا روشن در آید و در دوره دیگر به دلیل نوسانات اسیدی یا قلیایی بودن خاک، اثرآبیاری ویا کود دهی، تبدیل به ارغوانی شود. سبزی برگ بنفشه آفریقایی گاهی به صورت دو رنگ دیده می­شود که علت آن وجود رنگدانه­های کلروفیل، کاروتن و آنتوسیانین است، که در هر سلول برگ وجود دارد. دلیل ابلق بودن برگ در این گیاه نبود کلروفیل در قسمتی از برگ است. گیاهان با برگ­های ابلق به طور عموم گیاهان ضعیفتری هستند واحتیاج به مراقبت و توجه بیشتری دارند. بنفشه آفریقایی نسبت به طول روز بی تفاوت است و به همین علت در طول سال گل می دهد. رنگ گلها متنوع به رنگ بنفش، آبی، قرمز، صورتی و سفید ظاهرمی­شوند. گلها به صورت پرپروکم پر وپرچمها طلایی وبه طرززیبایی از وسط گلها بیرون زده اند. بطوریکه تناقص در رنگ پرچمها و گلبرگها گل را بصورت یکی از زیباترین مینیاتورهای گیاهی درآورده است. رعایت بعضی نکات پرورشی مانند هوای به نسبت خنک، نور کم واستفاده از کود بدون نیتروژون باعث بروز برگهای ابلق می­گردد. به طور کلی این گیاه به دو شکل رشد می­ کند:1-رشد گیاه با برگهای متقارن و مشابه گل رز که شکل رایج رشد است.
2-رشد گیاه بصورت رونده که اغلب برای قرار دادن گلدان­های آویز بسیار مناسب است(چارلز[3] ،1988 ).
اولین جشنواره بنفشه آفریقایی در 1946 میلادی در آتلانتا برگزارشد. شهرت این گیاه در حدی است که امروزه در بسیاری از کشورهای مدرن می­توان آن را مشاهده کرد. (کامپرز[4]،2009).
کشت بافت:
کشت بافت تکنیکی است که امکان تولید گیاه در محیط درون شیشه­ای را فراهم می­ کند. اساس این تکنیک توتی پوتانسی یا بس توانی(داشتن اطلاعات ژنتیکی هر سلول برای تبدیل شدن به یک گیاه کامل) است که بیان می­ کند هر سلول گیاهی دارای کلیه اطلاعات ژنتیکی لازم برای تبدیل شدن به یک گیاه کامل است. بنابراین کشت سلول، بافت یا اندام، این امکان را فراهم می­ کند که با کشت یکی از اجزای فوق سایرقسمتهای گیاه تشکیل شود. اصطلاح کشت بافت گیاهی در مورد تمام انواع کشتهای گیاهی استریل که در این ویترو انجام می پذیرند بکار رفته می­شود. این ویترو، جهت توصیف محیط کشت مصنوعی و استریل شده به کاربرده می­شود. از طرفی این ویترو برای معرفی شرایط غیر استریل طبیعی (شرایط باغچه و مزرعه)مورد استفاده قرار می­گردد.تکنیک کشت بافت گیاهی در حال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت مطالعه مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است. علاوه برآن در سالهای اخیراین تکنیکها کاربرد­های تجارتی گسترده­­ای در تکثیرگیاهان مختلفی منجمله گیاهان زینتی و دارویی و نیز حذف پاتوژنها از گیاهان پیدا نموده است. علاقمندی به کشت بافت گیاهی و توانایی آن در اصلاح و بهبود سازی گیاهان به صورت یک موضوع جهانی در آمده است. افزایش تعداد کشورهای عضو شرکت کننده در موسسه بین المللی کشت بافت گیاهی گواهی بر این ادعا می باشد. علاوه برآن هیات بیولوژی گیاهی موسسه تحقیقات سلولی بین المللی یونسکوآموزش تکنیکهای کشت بافت گیاهی را به عنوان یکی از برنامه ­های اولویت دار خویش معرفی نموده است.
شوری: شوری خاک مشکل جدی در تمام جهان است و به طور قابل توجهی باعث کاهش بهره برداری در زراعت می­شود(داسیلوا[5] و همکاران، 2008). تخمین زده می­شود بیش از 800 میلیون ­هکتاراز اراضی جهان تحت تاثیر شوری واقع شده است(فائو[6]،2008).وحدود0.020 از زمین­های شورناشی از سیستم­های نامناسب آبیاری می­باشند(مایک[7]و همکاران،2006). از آنجایی که تنش شوری یک تهدید بزرگ زیست محیطی برای کشاورزی محسوب می­شود، لذا درک پاسخهای پایه فیزیولوژیکی و بیوشیمیای گیاهان به تنش­ها، در افزایش بهره وری کشاورزی امری حیاتی است(کایانگ-شینگ وینگ-نینگ[8]،2009). تنش شوری یکی از مهمترین تنش­های غیر زیستی است و در خاک­های شور اثرات زیانباری بر بقاء، تولید ماده زنده و بازده محصولات گیاهی دارند. فرایند­هایی نظیر جوانه زنی، رشد دانه رست­ها، رشدرویشی، گلدهی و میوه دهی شدیدا تحت تاثیر شوری قرار می­گیرند. شوری از طریق زیر منجر به کاهش رشد و صدمه به گیاه می­شود:­

• استرس اسمزی (کاهش آب قابل دسترس گیاه )
• اثر ات سمی یون­ها (مخصوصا اثر ات نا شی از سدیم، کلروسولفات)
• برهم خوردن تعادل و جذب مواد مغذی ضروری

افزایش شوری، بیومس ریشه، برگ و اندام­ها را کاهش داده و متعاقب آ ن از طول ریشه و فتوسنتزی گیاه کاسته می­شود .(سینگ و پرساد[9] ،2009). البته در هر اندام گیاهی، گستره­­ای از انواع مختلف سلول­ها، با سنین متفاوت وجود دارد . لذا عملکرد­های متابولیکی و پاسخ­های متفاوت به محرک­های محیطی مورد انتظار است. گیاهانی که در معرض شوری قرار می­گیرند نه تنها کوچکترند بلکه دارای تغیراتی در پارامترها­ی فیزیولوژیکی و بیوشیمیا ی نیز هستند(هایلال[10]،1998).
انواع شوری و علل آن : شوری اولیه (طبیعی) شوری اولیه پیامدی از انباشته شدن نمک در خاک ویا آبهای زیرزمینی از طریق فرایند­های طبیعی در دوره­های طولانی است که توسط فرایند­های زیر صورت می­گیرد.-فرایند­ هوازدگی: این فرایند موجب شکسته شدن سنگها و آزاد شدن انواع نمکهای محلول، عمدتا کلر و سدیم و دیگر نمکها مانند کلسیم و منیزیم و تا حدی کمتر سولفاتها و کربناتها می­شود-رسوب نمک اقیانوسها: توسط عواملی همچون باد، این نمکها که عمدتا کلرید سدیم است جابجا می­شوند(قاسمی و همکاران،1995) شوری ثانویه (ناشی از فعالیت­های انسانی): یکی از دلایل عمده شوری ثانویه پاکسازی زمین و جایگزینی گیاهان یکساله بجای پوشش گیاهی پایا است. در آب و هوای خشک و نیمه خشک آب استفاده شده توسط پوشش گیاهی بومی منطقه، در تبادل با بارندگی سالیانه است. ریشه ­های عمیق گیاهان بومی نشان دهنده پایین بودن سطح سفره­های آبی می­باشند. پاکسازی و آبیاری این توازن را بر هم می­زند، بطوری که بارندگی از یک سو و آبیاری از سوی دیگر، آب را به میزانی بیش از نیاز گیاه فراهم کرده و این فزونی آب، سفره­های آب را بالا کشیده و نمکهایی را که قبلا در قسمت­های عمیق خاک ذخیره شده بودند حرکت داده و آنها را تا منطقه ریشه بالا می­آورد. با استفاده گیاهان از آب، نمک در خاک باقی مانده لذا در مصارف بعدی، آب موجود در خاک شورتر می­شود. سفره­های آب همچنان به سمت بالا و نزدیک سطح زمین کشیده می­شوند و با تبخیر آب، نمکها در سطح زمین باقی می مانند و این نمکها می­توانند وارد جریان آب شده و شوری را افزایش دهند (قاسمی و همکاران،1995).